植物组织培养怎样进行技术操作？

1.玻璃器皿的洗涤：

各种玻璃器皿均应先用洗衣粉洗净后，清水冲洗干净，放入洗液中浸24小时后用清洁水冲洗干净，再经蒸馏水冲洗一次，然后放入烘箱中烘干备用。

洗液的配制：一般采用重铬酸钾50克，加入蒸馏水10毫升，加温溶化，冷却后再缓缓注入90毫升工业硫酸。

2.培养基的制备：

（1）培养基的组成：主要成分包括各种无机盐（大量元素和微量元素）、有机化合物（蔗糖、维生素类、氨基酸、核酸或其他水解物等）、螯合剂（EDTA）和植物激素。固体培养基还应加入琼脂使培养基固化。

经常使用的培养基，可先将各种药品配成10倍或100倍的母液，放入冰箱中保存，用时再按比例取用。

①大量元素：将药品称取之后，分别溶解再依顺序混合定溶，配成10倍浓度的母液，每配制1毫升培养基时取母液100毫升。

②微量元素：微量元素用量少，为精确、方便称取，常配成100倍或1000倍的母液。每配制1毫升培养基时取母液10毫升或1毫升。

③有机化合物类，同微量元素一样，可配成100倍或1000倍的母液，使用时每1毫升培养基中取用10毫升或1毫升。

④铁盐（螯合剂）：铁盐是单独配制的，由硫酸亚铁5.57克和乙二铵四乙酸二钠7.45克，溶于1毫升水中配成，每配制1毫升培养基取用5毫升。

⑤植物激素：一般将植物激素配制成0.1～0.5毫克/毫升的溶液。由于植物激素多数难溶于水，可采用以下方法：

萘乙酸（NAA）：可溶于热水中或先溶于少量95%酒精中，再加水至一定浓度。

吲哚丁酸（IBA）：先用少量0.4%的NaOH溶液溶解，再加水到一定浓度。

吲哚乙酸（IAA）：先溶于少量95%酒精中，再加水到一定浓度。

2，4-D先用少量3.65%的HCl溶液溶解，再加水到一定浓度。

细胞分裂素：6-苄基嘌呤（6-BA）、激动素（KJ）需用3.65%的HCl或0.4%NaOH溶液先溶解后，再加水到一定浓度。

以上所配制的各种母液或单独配制的各种药液，均应放入2～4℃冰箱中保存，以防变质或微生物的污染。培养基中的蔗糖和琼脂，可依需要量随用随称取。

（2）培养基的配方：植物组织培养成功与否，在一定程度上决定于培养基的选择。不同培养基由于所含无机盐的量不同，其实验材料的反应也有差异。植物组织培养常用的培养基为MS培养基。铁盐的使用，除允许培养基用柠檬酸铁10毫克/毫升外，其余培养基都用铁盐母液5毫克/毫升。

表6-13常用培养基营养成分（单位：毫克/千克）

常用培养基营养成分（单位：毫克/千克）（续）-1

（3）培养基的制备程序：配置培养基时，首先按需要量依次吸取各种药液，混合在一起。将蔗糖放入溶化的琼脂中溶解，然后注入混合液，搅拌均匀后用0.4%的NaOH或3.65%的HCl溶液调节pH，再分装于三角瓶等培养容器内，用锡薄纸、羊皮纸等将容器口封紧包好。最后将分装后的培养基，放入高压灭菌锅中灭菌，一般采用1.1千克/厘米压力消毒灭菌15～20分钟，取出冷却凝固后备用。不同培养基在灭菌前应做好标记，防止混乱。

培养基的制作程度

3.接种：

常用消毒剂效果比较

为了得到无菌材料，在接种前必须先对植物材料进行消毒。一般采用化学试剂进行表面消毒。试剂选择及处理时间的长短，依植物材料对试剂的敏感性来决定，并且要选用消毒后容易除去的药剂，防止产生药害，影响愈合组织的发生。常用的消毒药剂有漂白粉（次氯酸钙）、安替福民（次氯酸钠），升汞等（表6-14）。在材料放入消毒剂之前，先用自来水冲洗或先在70%酒精中漂洗一下，有利于消毒剂渗入植物材料并杀死微生物，放入消毒剂消毒后，必须用无菌水认真冲洗几次，再进行接种。由于植物种类及所选用的植物器官或植物组织不同，在消毒顺序和消毒时间上也各不同。

接种用的植物材料（外植体）的大小和形状没有严格限制，但不能太小，过小细胞分裂难以发生。因此，一般要求切块的大小要适当。接种的全过程都应在无菌条件下进行。目前都是在超净工作台上完成，将植物材料接入培养基中即可。

4.培养：

植物组织培养和栽培植物一样，也受温度、光照、培养基的pH等各种环境条件的影响，培养中应严格控制培养室的条件。由于植物的种类，所取植物材料部位等的不同，所要求的环境条件也有差异。一般培养室保持在25±2℃的恒温条件，低于15℃培养物的生长停滞，高于35℃时对生长不利；光照强度为2000勒克斯，光照时间为10～12小时；对培养室内的湿度，一般不加控制，因装有培养基的容器内的湿度基本上能满足要求，外界环境的湿度过高容易造成污染；组培中培养基的pH通常为5.5～6.5。pH在4.0以下，7.0以上对生长都不利。培养不同的植物，选用不同的培养基所要求的pH也不同。

植物组织培养能否成功，选择适合的培养基极为重要。愈合组织的生长、分化和生根，又取决于培养基中激动素和生长素的含量，过高过低都不利于生长。

组培成苗的顺序为：

5.移栽：

组培幼苗移栽成活，是获得大批组培苗的最后一个重要环节，常因移栽不当而遭到损失。通常试管苗具有3～5条根后即可移栽。但长期在瓶内无菌条件下培养的小苗，直接移到室外，必须经过一个过度阶段。移栽前可将试管苗先打开，放在与培养条件相近的光照充足处，锻炼3～5天，使其适应环境后再移栽。移栽时用清水洗去根上的琼脂再栽入盆中，栽植土可选用通气好的粗砂、蛭石、珍珠岩均可，为保持温度，可用塑料薄膜覆盖，这样在室内保持10～30天，就可移至大田正常生长。由组培苗改为盆栽苗又是组培育苗成败的关键之一，因此，应控制好温度、湿度及光照。各种植物对环境条件的要求不同，应区别对待。