提质粒步骤

提质粒步骤如下：

一、步骤

1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2mlLB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管(离心管)，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4、加0.lml溶液I（1%葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0）充分混合。

5、加入0.2ml溶液II（0.2mM/LNaOH，1%SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5min.

6、加入0.15ml预冷溶液III（5mol/LKAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，置于冰浴5min.

7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管

8、加入等体积的异丙醇，混匀后静置10min.

9、以10，000rpm离心20min，弃上清。

10、用70%乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后，溶于50ulTE缓冲液中（或60℃温育去离子水）。

二、实验原理

提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。参考《分子克隆实验指南》。

三、提取窍门

1、加溶液II（裂解液）后，操作一定要温和，剧烈混合会导致基因组DNA污染。

2、洗脱时60℃温育（Ellution-Buffer）洗脱缓冲液或去离子水效果更好。

3、若质粒提取含量低，可增加菌液样或换用ArtMedia-Plasmid-Culture，其比LB培养基质粒得量高。

4、菌体应彻底悬浮，如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液II加入后，变成难以完全裂解的团块。这个团块在溶液III加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。

5、加入溶液II后，混匀，体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了，马上加入溶液III中和。

6、中和的操作，在1.5ml离心管中加入溶液III后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好。