酵母双杂交实验有哪些注意事项

注意事项

（1）酵母双杂交对照的设定 常规的酵母双杂交操作时一般会设定阳性对照、阴性对照以及显色系统对照三种对照，以MATCHMAKER GAL4酵母双杂交筛选系统为例：

阳性对照：pGADT7-T + pGBKT7-53，其中T蛋白和53蛋白是已经明确在酵母细胞内能够发生结合并启动报告基因表达的两种蛋白。

阴性对照：pGADT7-T + pGBKT7-lam，其中已经明确T蛋白和lam蛋白在酵母细胞内不能发生结合。 系统显色对照，pGADT7-Pcl1，该表达质粒转入酵母细胞就能引起?-半乳糖苷酶和?-半乳糖苷酶的分泌，从而检测显色系统是否有问题。

（2）假阳性现象 多种原因可能造成假阳性结果，常见的有以下三种：

筛到的文库蛋白自身具有转录活性，能够启动报告基因的表达——这种情况需要对筛到的候选蛋白进行自激活验证。

酵母细胞内可能同时含有不止一种文库蛋白，其中的一种文库蛋白可以与诱饵蛋白相互及结合。

这种情况需要对阳性克隆再次划板2~3次，以确保每一个酵母克隆中只含有一种文库蛋白和诱饵蛋白；另外划板的次数也不宜过多，否则会出现蛋白表达质粒丢失的情况。 其他一些不明原因造成的假阳性—这种情况需要将筛到的候选文库质粒和表达诱饵蛋白的质粒重新***转入酵母细胞或者通过酵母杂交的方式重新验证，如有必要可以将pGADT7-cDNA质粒与pGBKT7-bait质粒的载体对调构建成pGADT7-bait与pGBKT7-cDNA并重新在酵母细胞中验证，真正的阳性结合在对调以后也能在酵母细胞中做出阳性结果。

（3）常见的问题及参考方案 转化效率过低—尽量使用新鲜的培养基以及新鲜的、且直径大小在2~3 mm左右的酵母克隆，以确保酵母的活力；可将用于转化的质粒在使用前进行乙醇沉淀，以提高质粒的纯度和浓度。

杂交效率偏低—可能由于表达的融合蛋白对酵母细胞有毒性，在某些情况下在液体培养基中生长不好的酵母换到琼脂糖固体培养板上时，会生长得比较好，这种情况可以采用***转化的方法进行试验；或者将单转的酵母克隆分别铺到5块10 mm的培养板上，待克隆长出来以后，刮取所有克隆于5 mL 0.5×YPDA中。重悬后再按照常规杂交操作步骤进行操作。 背景过高—当使用HIS3作为报告基因时，由于HIS3基因具有一定程度的泄漏表达，可能会出现背景过高的情况，这时可以使用适量的HIS3蛋白竞争性抑制剂3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）以降低背景；或者再增加一种更加严格的报告基因的筛选如Ade。

诱饵蛋白具有自激活现象——可以采用克隆突变的方法将产生自激活一段氨基酸序列敲除或突变，但这种方法可能会破坏两蛋白之间的相互作用。