m6A都有哪些相关验证实验？来看一下吧

完整的实验离不开后续的验证。 话不多说，接下来我们就细数一下 MeRIP-seq ，都有哪些相关的 验证实验 吧~

首先，如果需要对m6A修饰位点进行严格的验证，可以用下面这个方法：

m6A-IP-qPCR ，也叫MeRIP-qPCR，即 m6A抗体富集到带甲基化修饰的RNA，下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量 的一种技术。

m6A修饰的过程，离不开 甲基转移酶（writer）、去甲基转移酶（eraser）和阅读蛋白（reader） 的作用。如下图，展示了与m6A修饰作用相关的 各种RNA结合蛋白 ：

所以， RNA-蛋白质 、 蛋白-蛋白互作 ，也是MeRIP-seq后续实验验证关注点，那么让我们看看验证RNA与蛋白以及蛋白质之间相互作用的实验有哪些吧~

主要是用来研究体内 RNA与蛋白结合 情况。比如，检测 reader蛋白与RNA 的具体结合情况。

该方法具体是利用 针对目标蛋白的抗体 把相应的 RNA-蛋白复合物沉淀 下来，通过 分离纯化 ，对结合在复合物上的RNA 进行 RT-PCR验证或测序分析 ，了解转录后调控网络动态过程。

（METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma. Molecular cancer, 2019）

研究 RNA与蛋白质互作 的一种技术。利用 生物素标记的RNA探针 ，通过与含有目的蛋白的溶液孵育，形成 RNA-蛋白质复合物 。复合物可以特异性结合磁珠，从而与孵育液中的其他蛋白分离。复合物洗脱后，通过 蛋白凝胶电泳实验 ，检测特定的RNA与蛋白的结合情况。

（METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma. Molecular cancer, 2019）

体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证 两个已知蛋白的相互作用 ，或者 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白 。

该实验基于 GST（glutathione-S-transferase），即谷胱甘肽-S-转移酶蛋白 ，可以与谷胱甘肽（Glutathione，GSH）结合。

将GSH固定于琼脂糖珠上，形成GSH-琼脂糖珠，将已知蛋白X与GST融合表达，获得的GST-X可与GSH-琼脂糖珠结合，若环境中存在与X蛋白互做的蛋白Y，则会形成 “琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y”复合物 ，与X蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。

（Sec62 promotes stemness and chemoresistance of human colorectal cancer through activating Wnt/β-catenin pathway. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research . 2021）

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多 蛋白质-蛋白质间的相互作用 被保留了下来。

如果用蛋白质A（图中红色方块）的抗体免疫沉淀A，那么与A在体内结合的蛋白质B（图中黑色方块）也能沉淀下来。 若B为已知蛋白，用WB验证A和B互作；若B为未知蛋白，用质谱可知与A互作的蛋白。

（METTL14 regulates M6A methylation-modified primary miR-19a to promote cardiovascular endothelial cell proliferation and invasion. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2020）

已知m6A修饰会影响 RNA的翻译效率 。 Ribosome profiling sequencing（Ribo-seq)） ，是针对核糖体结合的RNA进行测序。

该方法富集 与核糖体结合的正在翻译的RNA ，然后通过测序对富集的RNA进行定量，从而实现 对翻译强度进行定量 。

（1、N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 2015 Jun；

2、Ribosome Profiling: Global Views of Translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2018 July ）

检测RNA半衰期的方法有很多。比如，可以 利用转录抑制剂放线菌素D抑制细胞内基因转录后 ，在不同时间点收集总RNA，然后做 Northern或者RT-PCR ，比较不同时间点mRNA丰度的变化。如下图，Boxuan Simen Zhao.在“Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications”一文中通过半衰期讲述m6A修饰对mRNA稳定性的影响。

除了一系列的分子生物学上的验证，当然也少不了细胞水平和动物模型方面的实验，接下来也顺便简单了解一下吧![图片]

通常实验过程中，要证明某基因在细胞中行使什么样的功能，可以利用 质粒及慢病毒等载体 ，在细胞中对该基因进行 敲低（knockdown）、敲除（knockout） 或过 表达（overexpression） ，然后再通过 RNA-seq、免疫荧光、细胞表型（迁移、侵袭、增殖、凋亡、周期）实验 等，说明该基因在细胞内环境中行使的功能。

（1. Zhao W et al. METTL3 Facilitates Oral Squamous Cell Carcinoma Tumorigenesis by Enhancing c-Myc Stability via YTHDF1-Mediated m6A Modification. Mol Ther Nucleic Acids. 2020；

2. N6-Methyladenosine METTL3 Modulates the Proliferation and Apoptosis of Lens Epithelial Cells in Diabetic Cataract. Mol Ther Nucleic Acids. 2020）

是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物，可分为自发性动物模型和诱发性动物模型。

动物疾病模型，主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学（包括新药筛选）研究，涵盖动物 病理解剖、HE染色、免疫组织化学检测 等。

（1. RNA N6-methyladenosine methyltransferase-like 3 promotes liver cancer progression through YTHDF2-dependent posttranional silencing of SOCS2.Hepatology. 2018 Jun；

2. Anti-tumour immunity controlled through mRNA m6A methylation and YTHDF1 in dendritic cells. Nature. 2019 Feb）