CHIP-seq的案例分析

ChIP-Seq案例研究

Ellen Markljung等利用ChIP-Seq技术，发现：家猪IGF2基因（编码Insulin-like growth factor 2）第三内含子单碱基G→A的替换，导致抑制因子ZBED6在该基因上结合位点的丧失，从而使IGF2在骨骼肌中上调表达（表达量是正常情况的3倍），这一突变主要影响肌肉生长（提高了骨骼肌的数量，因此猪肉产量提高了3~4%）、心脏增大和脂肪沉积。

ZBED6基因与ZBED6蛋白

ZBED6基因：是失去转座功能的转座子，在所有哺乳动物中位于ZC3H11A基因第一内含子中；该基因在小鼠、大鼠、人、猩猩、狗、马、家猪中高度保守。Real-time-PCR分析显示，小鼠Zbed6 mRNA在脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、脾、尾和睾丸组织有不同程度地表达。

ZBED6蛋白是首次报道。ZBED6蛋白含有2个BED结构域和1个hATC二聚结构域；第61~80位和第231~248位氨基酸残基是2个细胞核定位信号（富Lys-Arg区段，KKKRKKGLRIKGKRRRKKLI）。该蛋白在哺乳动物中高度保守，尤其是DNA结合BED结构域，在26个物种中（包括家猪）显示出~100%相似性。

ZBED6蛋白作为抑制因子调控基因表达的方式

用siRNA将小鼠C2C12成肌细胞中的Zbed6基因沉默后的相关实验结果，证实了ZBED6蛋白作为抑制因子是通过与位于Igf2基因第三内含子中的QTN（Quantitative trait nucleotide）位点结合来抑制Igf2基因的表达。当Zbed6基因沉默后，Igf2基因的表达量升高、细胞增殖（肌管形成）加快、创伤愈合加快。

为了研究ZBED6蛋白作用靶点（Igf2基因及其下游基因），作者采用ChIP-Seq技术对小鼠C2C12成肌细胞进行分析。AB SOLiD测序得到：

①24million reads（比对到小鼠基因组上），2,499 Peaks；大多数峰（Peaks）集中在Igf2基因内含子中的QTN位点，即，QTN位点是ZBED6蛋白在基因组上的主要结合位点（图1）。

②GO注释分析发现，ZBED6蛋白的1200个作用靶点起着发育、转录调控、细胞分化等作用（图2）。其中，262个靶基因编码转录因子，36个含有Homeobox结构域，26个属于bHLH（basic helix-loop-helix）家族，10个属于FOX家族，8个细胞核受体，7个属于SOX家族（图3）。

综上所述，IGF2基因突变的家猪和Zbed6基因沉默的小鼠C2C12成肌细胞的表型效应、高度的序列保守、核定位、广泛的组织分布、许多靶基因有重要的生物学功能，这一系列现象说明：在哺乳动物中，ZBED6是一个重要的转录因子，影响着发育、细胞增殖和生长。

图1 小鼠C2C12细胞ChIP-Seq结果（A）Igf2基因内含子QTN位点ChIP-Seq Peak分布

图2 小鼠C2C12细胞ChIP-Seq结果（E）Gene Ontology分类

图3 小鼠C2C12细胞ChIP-Seq结果（F）ZBED6蛋白结合的转录因子家族