如何人工方法提高聚合酶的保真度

DNA聚合酶是PCR反应中不可或缺的组成部分，是参与DNA复制中的重要酶，被用在生物及医学等领域的各个研究方向上。PCR技术发明至今40多年的时间里，从早期被发现的Taq DNA聚合酶到现在，酶越来越多样化。随着新酶的发现和对旧酶的改造，DNA聚合酶的保真性、特异性、灵敏度等都获得了明显的改进

高保真DNA聚合酶有聚合中心和酶切中心，聚合中心具有5'→3'的DNA聚合酶活性，可沿 5'→3'方向催化合成 DNA；酶切中心具有3'→5'外切酶活性，可以进行碱基错配的修复。常见的高保真DNA聚合酶类型有Pfu、KOD等。

1653557024536074.png

图2. DNA聚合酶的作用原理[2]

如何选择高保真酶

对于测序、基因功能研究、蛋白表达、定点突变等，高保真性的扩增是非常重要的，可以确保各种扩增子的可靠扩增。以测序文库扩增过程为例，测序过程中的突变会给序列拼接造成困难，甚至会干扰某些需要低频检测的分析结果。对于市场上琳琅满目的各种高保真DNA聚合酶，选择一款合适的酶产品是极为必要的。市面上常见的高保真酶特性主要包含保真度、扩增速率、特异性、是否耐U等。

保真度：错配率是计算高保真DNA聚合酶保真性的一个通用标准，错配率越低代表其保真性越好，保真度常用错配率的倒数表示（保真度=1/错配率），不同的测定方法也会产生不同的结果。常见的测定方法有以下三种：

检测方法

检测原理

优缺点

蓝白斑筛选测定

利用DNA聚合酶扩增lacZ基因，它可以还原β-半乳糖苷酶基因活性并产生蓝色菌落，结合蓝白斑筛选的结果可以评估保真度。

快速、相对简单、经济有效；但是精确度不高，无法区分DNA的同义突变。

一代测序

将PCR扩增产物克隆至相应的载体中，通过对转化后的单菌落进行Sanger测序，对测序结果中错配的核苷酸数进行分析其保真度。

精确度高，可以检测到所有的突变，但是工作量和成本都比较高。

NGS测序

使用NGS平台，将PCR扩增后的经相应处理后的文库产物进行测序分析，从而计算DNA聚合酶扩增过程中的保真度。

精确度高，可以检测到DNA突变。但是测序平台本身有一定的错误率，且读长受限较大。

翌圣有多款表现稳定的高保真DNA聚合酶。其中，Hieff Canace? Plus High-Fidelity DNA Polymerase（Cat#10153，简称Canace plus）具有一流的保真度，其保真性是Taq酶的83倍，Pfu酶的9倍。

1653557273352628.png

图3. Canace plus的保真度

扩增速率：合成能力是评估高保真DNA聚合酶非常重要的因素。原始的高保真DNA聚合酶因为具有较强的3'→5'外切酶活性，其合成能力较低。例如Pfu DNA聚合酶的合成速率还不到Taq DNA聚合酶的一半，但是翌圣Canace系列高保真酶，通过基因改造，聚合能力明显提升，Hieff Canace? Plus High-Fidelity DNA Polymerase（Cat#10153，简称Canace plus）扩增速率可至10 sec/kb。

1653557327300032.png

图4. Canace plus的扩增速率低至10 sec/kb。Canace plus分别扩增水稻gDNA 2 kb片段和小鼠gDNA 4 kb，模板投入量50 ng，35个循环，M：1 kb DNA Marker。

特异性：PCR扩增由低温上升至高温的过程中，酶的弱活性极易造成错配或形成引物二聚体，这种非特异性扩增会显著降低产物质量。为了减少这种现象的发生，可以人为的在开始延伸之前不让酶发挥活性，以保证扩增的特异性，这种方式也被形容为酶的热启动。Hieff Canace? Plus High-Fidelity DNA Polymerase(Cat#10153)具备热启动特性，具有特异性高、灵敏性高、产量高的特点。

1653557358919151.png

图5. Canace plus扩增性能好。分别采用Canace plus(A)和市售高保真酶（竞品1-B、竞品2 -C）扩增小鼠gDNA 4 kb，M：1 kb DNA Marker。

是否耐U：Pfu校正DNA聚合酶不能兼容dUTP，需要经过特殊改造后方可耐受尿嘧啶，然后才能应用甲基化文库构建或者定点突变等。Hieff Canace? Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase(Cat#10145)是翌圣针对含尿嘧啶模板设计的高保真DNA聚合酶，根据其甲基化文库产量，可以看出其扩增性能非常好。

样本种类

甲基化文库构建

耐U高保真聚合酶(加入相同单位)

Yeasen

Input DNA (ng)

4.5

扩增循环数 (cycles)

平均产量(ng)

26.3

17.9

翌圣高保真DNA聚合酶选择指南

产品定位

产品名称

货号

主要应用

超高保真

Hieff Canace? Plus High-Fidelity DNA Polymerase

10153ES

分子克隆

扩增含U模板

Hieff Canace? Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase

10145ES

甲基化模板扩增

高效率高保真

Hieff Canace? Pro High-Fidelity DNA Polymerase

13476ES

高通量测序

Q&A

1. Q：高保真DNA聚合酶扩增产物为平末端，TA克隆（或二代测序文库构建）如何在产物末端加A？

A：Taq DNA聚合酶(Yeasen Cat#13486)具有的脱氧核苷酸转移酶活性可以在PCR产物的3'末端添加一个核苷酸“A”，反应体系和实验条件可参照相应产品说明书。

2. Q：不同的高保真DNA聚合酶产品保真度有可比性吗？

A：不同公司测定保真度的方法不同，产生的结果也不一样，酶的保真度必须采用同种方法下才能够相互比较