Transwell细胞体外侵袭实验的注意事项

2. 1

NIH3T3 细胞制备的趋化因子与胎牛血清　趋化因子是能使细胞产生趋化运动的一类细胞因子[2 ] 。目前利用NIH3T3 细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验的实验室比较多,时间较长且实验步骤繁琐。众所周知,胎牛血清中有趋化因子,我们在不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验中发现用胎牛血清和用NIH3T3 细胞制备的趋化因子做细胞体外侵袭实验效果是一样的,两组迁移的细胞数很接近。在实验时间上，用NIH3 T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为1 周,而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为2 d ,实验时间节省了很多。因此认为可以用胎牛血清来代替NIH3T3 细胞制备的趋化因子。

2. 2细胞的准备　所需细胞应处在对数生长期,细胞活力需大于95 %。如果细胞活力小,就会造成细胞穿透能力下降,影响实验结果。

2. 3擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞　先用干棉签将上室内液体吸去,再用蒸馏水浸湿的棉签轻轻擦去Mat rigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞,如果没有擦净聚碳酯膜上表面的细胞,在细胞计数时就会将没擦掉的细胞也计进来。尤其是细胞为圆形的时候,就会分辨不出是穿过去的细胞还是没穿过去的细胞,对于长梭形细胞来说,穿过去的细胞为长梭形,没穿过去的细胞多为圆形。

2. 4苏木素染色　上室浸泡在新苏木素中的时间为1 min ,用过多次的苏木素为2 min。在研究粉防己碱对HUVEC 人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用没有将多余苏木素洗去,直接脱水、透明,造成细胞图片背景模糊,细胞不清楚。在作不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验时我们将其置于盛有自来水的烧杯中,反复漂洗几次,将多余苏木素洗去再行脱水、透明;这样做出的细胞图片背景干净,细胞清楚。

2. 5脱水和透明时间　脱水时间各为1 min ,在二甲苯中的时间不要过长,以2 min～3 min 为宜;尤其是同时操作多个样本时,时间过长就会造成部分聚碳酯膜从上室基底部自动脱落下来,上室间粘连在一起,造成样本混淆,实验失败。建议在最后一步实验时需二人协做,一人辨别并取出样本,一人小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片并及时编号。

2. 6细胞计数　当实验用的细胞为圆形时,实验人员容易将聚碳酯膜上小孔误认为细胞进行计数。我们在作VEGF 对人结肠癌HT229 细胞体外侵袭能力的影响时,发现HT229细胞很小,很容易将聚碳酯膜上小孔误认为细胞进行计数 。