heidolph

磺胺二甲嘧啶(SM )是畜牧生产中应用最广泛

的磺胺类药物之一。广泛用于畜禽疾病的治疗和预

防，食用含磺胺二甲嘧啶的动物组织，能导致机体发

生过敏反应，破坏机体正常菌群生态平衡，引起致病

菌产生耐药性|1]。我国、欧盟和FAO／wH0规定，

动物组织中SM 最高残留限量为100 ug／kg。畜牧

生产中应用的磺胺类药物进入外界环境，可能随污

水或地表径流，渗漏进入地下水或污染附近的池塘，

对水环境中的非靶生物可能产生毒性或在其体内富

集，造成环境污染[2]。由此引起的该药物在水产品

中的残留也受到关注。

在动物体内，磺胺二甲嘧啶主要经乙酰化酶代

谢形成N 一乙酰化磺胺二甲嘧啶(N 一ACE—

SM )L3州]。在人体内，N -ACE-SM 可逆转化成为

药物原形，从而具有药理活性。因而，N 一ACE—SM

的残留测定也是有必要的。日本规定磺胺二甲嘧啶

的残留标识物为磺胺二甲嘧啶原形和N -ACE—

SMz L6J。本文建立了磺胺二甲嘧啶原形和乙酰化磺

胺二甲嘧啶残留的高效液相色谱测定法。

l 材料与方法

1．1 试验材料

1．1．1 标准品 磺胺二甲嘧啶，白色结晶，纯度>99 ，美国Sigma公司；N 一乙酰化磺胺二甲嘧啶，

白色结晶，由本实验室自行合成。

1．1．2 主要试剂 乙腈，色谱纯，Fisher公司；冰醋

酸：分析纯，北京化学试剂公司；正己烷，无水硫酸钠

和正丙醇：均为分析纯，北京化工厂。

1．1．3 主要仪器设备 高效液相色谱仪：SCL-

10AVP系统控制仪，DGU-12A 脱气装置SPDM10AVP

二极管阵列检测器，LC一10ATVP泵，

Class—VP工作站(日本Shimadzu公司)。调速多用

振荡器：HY一4型，常州同华电器有限公司。组织匀

浆机：Nissei AM-6，日本Ace公司。旋转蒸发器：

Laborota 4003型，德国Heidolph公司。离心机：

LD4-2A，北京医用离心机厂。电子天平：0．01 mg，

Sartorius公司。微量移液器：北京青云航空仪表有

限公司。磁力搅拌器：7 8-1型，浙江乐清乐成电器

厂。隔膜真空泵(GM-0．33)、溶剂过滤器，均为天津

市腾达过滤器件厂产品。SPE柱：Sep-Pak Vac

12cc(2g)碱性氧化铝柱，美国Waters公司。

1．2 试验方法

1．2．1 色谱条件 色谱柱：C e反相液相色谱柱，

Inertsil ODS-3(4．6 mm×250 mm，粒径5 m)；流

动相：水一乙腈一乙酸(76：24：0．05，V／V／V)；检测

波长：265 nm；进样量：50 ttL；流速：1 mL／mim。

1．2．2 标准溶液的配置 精密称取SM 和N 一

ACE-SMz各0．010 0 g，用乙腈溶解并定容至100

mL，配置成100 ttg／mL的2种标准贮备液，一20℃

避光保存。标准贮备液再用乙腈稀释，配置成浓度

为10 ttg／mL标准工作液，一20℃避光保存。

1．2．3 标准曲线绘制于测定当日用流动相将SM 、N 一ACE—SM 的标准工作液稀释，配制成浓度

为0．01、0．02、0．05、0．10、0．50、1．00 和2．50

t*g／mL的混合标准溶液，各取50 L进样，HPLC检

测，对峰面积积分。每一浓度进样5次，取平均值，

然后以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制上

述2种化合物的标准曲线，求出回归曲线和相关系

数。

1．2．4 样品前处理

1．2．4．1 提取和净化：鲟鱼肌肉去皮，于15 000

r／rain匀浆3 rain后，准确称取2．00 g肌肉组织匀

浆，加入乙腈25 mL，无水硫酸钠4 g，中速振荡20

rain，3 000 r／rain离心5 rain。取上清于含30 mL

正己烷的100 mL分液漏斗中，振摇1 rain，静置20

rain，收集下层。分离后的残渣再用25 mL乙腈提

取1次，振荡20 rain后，3 000 r／rain离心5 rain。

倒入分液漏斗中振荡2 rain后静置分层，合并2次

所得的下层溶液，加入正丙醇10 mL，40℃下减压

蒸馏，残留物用5 mL乙腈一水(95：5，V／V)溶解。

1．2．4．2 萃取：预先用15 mL乙腈一水(95：5，

V／V)平衡Sep—Pak Vac 12cc(2g)碱性氧化铝柱，

然后上样，用5 mL乙腈一水(95：5，V／V)洗涤，不

收集；再用5 mL乙腈一水(75：25，V／V)洗脱，收集

洗脱液，氮气吹至近干，残留物用流动相定容至2．0

mL，所制样液用高效液相色谱仪进行检测。

1．2．5 回收率的测定设20、100、2 000 t*g／kg 3

个组织添加水平，并设空白对照，每个水平设5个平

行。分别称取匀浆肌肉组织2．00 g，添加一定体积

的标准工作液，使肌肉组织中药物浓度分别为20、

100、2 000 t*g／kg，涡动1 rain，静置10 rain，按样品

前处理方法进行处理后进HPLC分析。根据各组分的峰面积计算其浓度和回收率。

1．2．6 检测限的测定10个空白鲟鱼肌肉样品，每

个空白肌肉准确称取2．00 g，按样品前处理方法处

理，测得基线噪音值，按信噪比为3计算，求得鲟鱼肌

肉组织中SM。和N 一ACE-SM2测定方法的检测限。

1．2．7 精密度的测定 3 d内，每日准确称取匀浆

组织各2．00 g，每个浓度3个平行，分别添加一定体

积的标准溶液，使组织中SM 和N 一ACE—SM 药

物浓度为20、100、2 000 t,g／kg，涡动1 rain，静置1O

rain后，按样品前处理方法进行处理。El内每个浓

度取5个样品，每个样品重复进样测定5次，上述3

个添加浓度分别作3个El间重复。求各组分的峰面

积，计算2种药物在El内与El间回收率的平均值与

标准误。

2 结 果

2．1 标准曲线

取上述配制的各浓度的磺胺二甲嘧啶、N 一乙酰

化磺胺二甲嘧啶混合标准工作液在选定的色谱条件

下进行测定，在浓度为0．01～2．0 p．g／mI 范围内，

色谱峰面积与浓度呈线性相关。如表1所示，标准

品和样品的色谱图见图1。

表1 SM：、N‘一ACE-SM：标准曲线回归方程与相关系数

Table 1 Standard curves regression equations and

correlative coefficients of SM 2 and N‘-ACE-SM2

2．2 检测限

根据10个空白组织的基线噪音值，求其平均

值，以平均噪音的3倍计算检测限，求得肌肉组织中

SM，、N —ACE—SM2的检测限均为10．0 ttg／kg。

2．3 添加回收率和精密度

在20、100、2 000 ttg／kg(低、中、高)3个浓度的

添加水平，对鲟鱼肌肉样本进行添加回收试验，结果

见表2和表3。

表2 鲟鱼肌肉组织中SM：、N4_ACE—SM：的添

加回收率(n-5)

Table 2 Recovery of SM2 and N4_ACE·SM2

from fortified m uscles

3 讨 论

3．1 样品提取

关于肌肉组织中磺胺二甲嘧啶、N 一乙酰化磺胺

二甲嘧啶的提取方法，已有的报道大多用二氯甲

烷[川、乙腈 或偏磷酸一甲醇(2：1，V／V)[ 作提取

溶剂。用二氯甲烷提取时，组织漂浮在提取溶剂表

面，倾倒困难；使用偏磷酸一甲醇作提取溶剂，由于含

有大量的水分，造成减压蒸馏耗时费力；使用乙酸乙酯提取效率最高，但提取的组织内源性物质也最多，

净化较困难，净化方法还需要进一步研究。采用乙

腈作提取溶剂，提取效率较低，但增加提取溶剂的

量，可获得满意的回收率，另外用乙腈提取时***提的

杂质也较少。经过反复试验，用25 mL乙腈，提取2

次，可将目标分析物提取出来。

盐析会促进溶质的析出，可提高有机溶剂提取

效果。本试验在提取溶剂中加入无水NazSO ，提

高了磺胺二甲嘧啶和N 一乙酰化磺胺二甲嘧啶的提

取效率，当Na SO 加至4 g时，回收率不再增加。

因此，选用添加无水硫酸钠的量为4 g。

3．2 样品净化

样品净化是样品前处理步骤中关键的一步，选

择SPE柱的种类尤为重要，它直接关系到方法的回

收率。文献报道用于净化的SPE柱有C。。柱[3 ]，本

方法选用的碱性氧化铝柱为正相柱，洗脱溶剂黏滞

系数小，自然状态下很快流干，操作较简单。

3．3 检测

磺胺类药物的检测，文献报道有紫外检测器、荧

光检测器和电化学检测器。电化学检测器的电极需

要稳定的时间较长，样品杂质容易污染电极。荧光

检测器的灵敏度和选择性比紫外检测器高。SM

用荧光胺衍生化后生成的产物具有荧光性，但N 一

ACE—SM 不能用荧光胺衍生化，限制了荧光检测器

的应用。紫外检测器为目前测定磺胺类药物最常用

的检测器，可直接测定，无需衍生化，简捷迅速。我

们采用二极管阵列检测器检测，选取两种药物光谱

图的最大吸收波长作测定波长。光谱见图2。

3．4 回收率与检测限

在本试验条件下，对鲟鱼肌肉组织在20、100、

2 000 ttg／kg添加浓度范围内，磺胺二甲嘧啶、N 一乙

酰化磺胺二甲嘧啶的检测限均为10．0“g／kg。Ho—

rie等L7 报道用于测定肌肉中上述两种药物方法的

检测限为20．0 gg／kg，本方法的检测限低于文献报

道值；回收率与之接近，但本方法操作较简单。

3．5 操作注意事项

磺胺类药物在高温、光线直射、空气暴露等环境

条件下，会部分降解氧化损失，故在样品提取净化

操作过程中，要尽可能在避光、室温小于25℃条件

下操作，所用的器皿也应尽可能采用棕色；标准液

及样液应在冷藏、避光条件下保存；样液也应尽快分

析。本试验结果表明，100 ttg／mL 的标准液在

一20℃、黑暗条件下可保存6个月。

图没办法上传，加我qq445177317，可以给你，写百度知道就可。