限制性片段分析需要用什么方法

1.PCR扩增：PCR反应体系为20μl，含模板2μl(约50ng)，引物各1.6μl，dNTP1.6μl(0.4mM)，10×Buffer缓冲液2μl，Taq酶0.5U，加双蒸水至20.0μl；PCR反应条件为95℃2min，94℃30sec/64℃30sec/72℃30sec(5个循环)，94℃30sec/63℃30sec/72℃30sec(5个循环)，94℃30sec/60℃30sec/72℃25sec(23个循环)，94℃30sec/60℃30sec/72℃1min。

2.PCR 扩增产物的检测：取PCR 扩增产物2μl，以1%的琼脂糖凝胶潜水电泳法检测靶DNA 片段的扩增产物。

3.酶消化反应：取PCR 产物约2.0μl，加限制性内切酶BstN I1U，10×酶消化反应缓冲液1.0μl，蒸溜水补至10.0μl 置试验管中。37℃温箱中孵育4h。

4.酶切产物电泳分型：6%聚丙烯酰胺凝胶电泳（T=6%，C=3.3%，凝胶规格为82mm×64mm×0.75mm）。电极缓冲液为1×TBE。将加有1/5 体积上样缓冲液的酶切产物电泳，220 v 电压，电泳2－3h。

5.银染显色将凝胶剥离至染色盘中，用10%冰醋酸固定30min,去除固定液，用蒸馏水冲洗凝胶3 次（2min 以内）。将0.1%硝酸银溶液200ml 倒入染色盘中，染色30min，倒掉染色液，蒸馏水快速冲洗凝胶1 次（20s 以内）。显色液200ml（3% Na2CO3，含0.05%甲醛，2‰Na2S2O3）倒入染色盘中，不断震荡，直至谱带显示清晰。用固定液终止显色。蒸馏水洗涤一次，贴于滤纸上晾干保存。