致瘤土壤杆菌Ti质粒基因转化载体的构建是怎样的？

1.Ti质粒

Ti质粒即致瘤质粒（tumorinducingplasmid），是致瘤土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）核外遗传物质，为双链环状DNA分子，长度约200kb，分子量为（90～150）*106u。该菌从伤口侵染植物，病株上形成膨大的瘿瘤。瘿瘤细胞能合成正常植物体内所没有的冠瘿碱（opine）。Ti质粒带有合成冠瘿碱的相关基因，根据所诱导的植物肿瘤中所含冠瘿碱种类不同，Ti质粒可分为4类，即章鱼碱（octopine）型、胭脂碱（nopaline）型、农瘿碱（agropine）型和农杆碱（agrocinopine）型等。致瘤土壤杆菌侵入植物后，其Ti质粒上的T-DNA区序列能够转移并整合到植物染色体上。

2.Ti质粒转化载体系统虽然Ti质粒能将外源基因引进植物，并能表达其产物，但由于野生型Ti质粒有许多缺点，在基因工程中不直接使用野生型Ti质粒。其T-DNA区具有控制茎、根分化的基因，这些基因随T-DNA区一起整合到植物基因组后，会破坏植物体内的激素平衡，引起不正常的生长和分化，以至不能再生成植株。为了使Ti质粒成为有效的外源基因导入载体，就需要对野生型Ti质粒进行改造，切除致瘤基因，使之成为“卸甲”载体（disarmedvector）。切除后造成T-DNA区大段缺失，或者在T-DNA区上插入外源基因，都不影响T-DNA区的转移和整合功能。

目前主要采用两种Ti质粒基因转化载体系统，即***整合载体系统和双元载体系统（binaryvectorsystem）。

***整合载体Ti质粒上的T-DNA区编码致瘤基因序列，一般为pBR322质粒DNA所取代，但保留两末端重复序列。带有外源基因的pBR322衍生中间载体，由大肠杆菌进入致瘤土壤杆菌中，两者相同的pBR322序列发生同源重组，外源基因就整合到卸甲Ti质粒的T-DNA上。所用中间载体不仅含有与Ti质粒T-DNA区同源的序列，还具有一个或几个细菌选择标记基因、阳性植物选择标记和单一的限制性内切酶座位等，且无Ti质粒的两末端边界序列。常用***整合载体系统有pGV3850系统、pGV2260系统、pMON220系统等。