数字PCR（二）— Bio-rad ddPCR

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变

A：最低微滴上样量是和您的实验的突变比例灵敏度需求相关的，人类cfDNA的具体上样需求，可见下表

A：按照泊松分布原理，小于等于5 copies/droplet（100000copies/20ul）的核酸浓度，都能保证总体内有空余微滴存在，通过统计学换算，都可以保证结果稳定，并非必须要求每个微滴单拷贝。20,000个微滴对应的是100,000个拷贝的核酸。即使总微滴数有损失，一般15,000个微滴对应的检测上限也应该是75,000个拷贝。

理论上讲只要有还有1个阴性微滴，ddPCR基于Possion分布都能计算出样本的含量，但是CV%会非常大。可以接受的动态范围是CV%<5%的样本含量范围。对于任何dPCR平台，最佳样本浓度都是λ=0.16时对应的浓度，这个时候CV%是最小的（~1.5%），对应就是最佳上样量了。不过在实际测试中，样本浓度在平台要求的动态范围之内都是OK 的

对于20000个微滴，样本浓度的上限（理论上λ=5.5），对应的阳性微滴比例为99.6%，阴性微滴的比例为0.4%，对应阴性微滴的数量是80个。也就是阴性微滴数超过80个是OK的。其实理论上还可以更少，但是考虑到其他不确定度，这个数比较接近实测结果

答：微滴数量低于9000个，从统计学角度来说，抽样量太少，无法使用泊松分布校正，尤其对于高浓度样本来说，定量误差会比较大，检测上限也会降低。如果存在复孔，由于复孔间所有微滴都是独立反应体系，所以可以合并分析复孔数据，将多孔视作一孔。

对于QX200系统来说，如果反应体积是20微升，那么生成的微滴数在20000个左右。实际检测少于20000个，往往来源于系统的死体积、微滴转移时的损失及其他不确定因素。也就是说，微滴制备后，靶标核酸已经随机分布在20000个微滴中，阳性微滴的百分比已经确立，那么后续分析的微滴数量不到20000个，对定量的结果也是无影响的（浓度适合的样本）。实际上我们也遇到过，相同的样本，不同的批次检测，总微滴的数量从4000-20000不等，但是定量的结果无差别。注意，以上的说法前提是“浓度合适的样本”，如果样本浓度太高和太低时，分析的总微滴数偏少，会增加又一个环节的subsampling error,定量的准确性和精度就会受影响了。所以为什么定义8000个微滴，一方面是基于质控的角度。未达到这么多微滴，肯定是有问题的，建议重做；另一方面，对于浓度超高或超低的样本，8000个微滴带来的误差仍小于样本本身取样误差带来影响。

A：样本中的蛋白、有机溶剂、表面活性剂、高粘度物质，生成微滴时的环境温度，PCR时的等因素会影响微滴数量。血液样本中主要判断为蛋白残留以及提取过程中没有除尽的酒精。

答：引物探针一般都是用水或TE溶解，且在整个20微升反应体系内占比很少，所以对最终反应体系的离子强度或pH影响极低。且ddPCR反应预混合本身就是缓冲液，能维持相对稳定的pH。样本一般也是TE或纯水洗脱，如果提取没有问题的话那对体系也基本没有影响，唯一可能的情况是极高的盐离子浓度提高了微滴渗透压影响了内外相平衡，但一般人血为等渗溶液，不会有这么高的盐浓度，除非提取试剂盒有问题，过柱浓缩时洗不掉样品中过高的离子浓度。相比样本中的蛋白、有机溶剂、表面活性剂、高粘度物质来讲，离子对微滴的影响微乎其微。

A：最终测得有效微滴数量超过10,000个，1维图中微滴高度没有出现阶梯式排布，即可认为微滴稳定。

A：ddPCR实验有效性需要分几个方面区分：

理论灵敏度为1个拷贝核酸。实际灵敏度针对您的不同Assay及不同提取手段是需要具体分析的，重复性在不同Assay的不同的浓度范围内也是不同的。您需要参考文献、自身实验、或FDA医疗器械注册时的验证数据。

对于一台PCR仪器一般很少有用分析灵敏度的说法，因为每一种不同的序列都可以判断为不同的分析物，同一种方法针对不同分析物的LLD、BLD、AS、FS都是不同的，需要精确到不同的应用方向和应用试剂。

A：Bio-Rad不同的ddPCR supermix产生的微滴体积都有差别，这就是为什么要在setup实验时，要在软件中正确选择对应的supermix种类，软件会自动调用对应试剂的微滴体积进行计算。不同试剂的微滴体积，在研发时已经通过测试获得并应用于quantasoft软件的计算中

A：1.单孔微滴数量不够，2. 单孔样本上样量不够，3. 需要计算技术重复间的平均值和置信区间。如果实验中有perform技术重复，通常情况下建议merge各技术重复的微滴进行分析，可提高数据的精确度

A：双重ddPCR实验中，如果两重反应间互有干扰或竞争（表现形式一般为四团微滴无法处于矩形的线上），则使用索套法划分微滴会更精确。（如有实例，可现场讨论）

这两个定量结果其实并不矛盾。但对于ddPCR开发的mutation detection assays, 到底该用拷贝数还是用突变率作为LOD仍然有待讨论。对于Liquid biopsy来说，可能两个检测结果同时分析才更有实际指导意义。个人倾向于用拷贝数浓度，而野生型的结果是必不可少的IPC。突变比例的测定可能会受样本制备的影响。

如果加入新的荧光标记或者阴性微滴的本底荧光信号出现负值时，需要校正补偿。